隐孢子虫病是一种人兽共患寄生原虫病，主要引起人和动物腹泻、消瘦、恶病质，甚至死亡，被美国CDC（美国疾病控制中心）列为六大腹泻病之一，三大主要暴发病之一，且至今尚无有效的防治措施。据报道，该病在艾滋病患者中的发病率更高，此外，该病已成为危害国际安全环境的因素之一。本研究主要是建立微小隐孢子虫cDNA文库并用此筛选保护性抗原基因进行免疫学防治和检测方法的研究。隐孢子虫cDNA文库构建及其应用研究，属河南职业技术师范学院重点课题资助项目（09106）。起止时间为1999年元月－2002年12月，经过四年的努力工作，现已圆满完成。

成果内容简介

本研究主要是建立微小隐孢子虫cDNA文库并用此筛选保护性抗原基因进行免疫学防治和检测方法的研究。本研究首先利用pUC18载体在国内首次成功地构建了微小隐孢子虫cDNA文库。该文库容量为1.9×10⁶，文库中cDNA插入片段大小介于0.4×10³～6.5×10³bp之间。从微小隐孢子虫cDNA文库中扩增出编码微小隐孢子虫子孢子表面蛋白3个保护性抗原基因CP15、CP15/60和CP23。构建3个真核表达载体：pCR3.1-15、pcDNA3-15/60和pCR3.1-23。应用真核表达质粒在不同的条件下免疫BALB/c小鼠，核酸疫苗免疫母鼠产生的母源抗体对仔鼠具有一定的保护作用。分别将pCR3.1-23单一质粒和3种质粒的混合物经鼻粘膜接种妊娠山羊，并对免疫山羊的后代进行攻虫试验。结果表明核酸疫苗能够诱导母羊产生免疫反应，母羊能够将免疫保护力传给后代，试验组后代和对照组相比，攻虫后卵囊排出量和排出时间缩短，体重增长较快。构建3个原核表达载体：pET-28a-15、pET-28a-15/60和pET-28a-23，以在E.coli中高效表达的融合蛋白为包被抗原，以辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG为二抗，建立了检测微小隐孢子虫抗体的间接ELISA方法。最佳反应条件为：0.5μg/孔纯化的E.coli表达的CP15重组蛋白包被酶标板（CP15/60和CP23的包被量为1.0μg/孔），用10%兔血清进行封闭，以正常E.coli裂解上清液稀释待检血清。结果表明应用重组抗原蛋白作为诊断微小隐孢子虫包被抗原具有特异性高，抗原易纯化，成本低等特点。

推广应用情况：

采用构建文库已经成功扩增3个保护性抗原基因，并用此构建核酸疫苗和建立检测隐孢子虫的ELISA检测方法。初步应用表明构建的核酸疫苗具有一定的免疫保护作用，检测方法具有特异性高，抗原易纯化，成本低等特点。